Сайт-специфична рекомбинация на ДНК

Раздел 16

САЙТ-СПЕЦИФИЧНА РЕКОМБИНАЦИЯ НА ДНК

1. Механизъм

Сайт-специфичната рекомбинация на ДНК в редица отношения се различава от разгледаната в предишния раздел обща (хомоложна) рекомбинация. Общата рекомбинация е повсеместен и жизнено важен процес. Сайт-специфичната рекомбинация се използва най-вече от малки молекули ДНК за тяхна собствена изгода, която не винаги е съвместима с интересите на клетката. Общата рекомбинация обикновено леко модифицира участващите ДНК-молекули. Сайт-специфичната рекомбинация въвежда значителни преобразувания – въпросната малка (но не чак незабележима) молекула се вмъква в хромозомата, изрязва се от нея или се премества по дължината й.

1.1. Интеграция

Вмъкването на малка ДНК-молекула в хромозома се нарича още интеграция, а някои от ензимите, участващи в сайт-специфичната рекомбинация – интегрази. Според първичната структура на ДНК-молекулите и участващите ензими интегрирането може да стане по два начина. Единият от тях изисква хромозомата и малката молекула да споделят къс хомоложен участък. Ензим (ендонуклеаза) прави никове в двата края на тази последователност. И хромозомата, и малката ДНК се разкъсват, давайки сходни едноверижни (лепливи) крайни участъци. Лепливите краища на хромозомата се сдвояват с тези на другия фрагмент ДНК. Нужна е само ДНК-лигазна реакция, за да се окаже малката ДНК включена в хромозомата. В показания пример малката ДНК, която поема инициативата, е пръстенна. Ако е линейна, това дори улеснява нещата, защото първото срязване се спестява (но краищата трябва да се държат сближени).

В резултат на сайт-специфичната рекомбинация от две ДНК-молекули е получена една. В краищата на интегрираната ДНК се разполагат две копия на късия хомоложен участък. Те са еднакво обърнати. Такива повтори, ориентирани в една посока, се наричат прави. (Когато две копия на дадена последователност са ориентирани срещуположно върху една ДНК-молекула, те се наричат обърнати или инвертирани повтори.)
Другият начин за вмъкване в хромозомата не изисква никаква хомология. От хромозомата случайно се избира къс участък и (както и в първия случай) се загражда с никове. В малката ДНК се прави двуверижно равно (”тъпо”) срязване – разкъсват се две срещуположни фосфодиестерни връзки. Следва ДНК-лигазна реакция. От двете страни на интегрираната последователност остават едноверижни празнини. Те се разглеждат от клетката като повреда и се запълват от ДНК-полимераза и ДНК-лигаза. Така късият хромозомен участък, който е бил разкъсан, се оказва дуплициран от двете страни на интегрираната ДНК. И тези повтори са прави като получените по първия начин.

1.2. Транспозиция и дупликация

ДНК-участък, разположен между прави повтори, лесно може да се изреже от хромозомата. При хибридизация на повторите ще се образува примка, както е показано на схемата.

        Всяка еднократна рекомбинация в сдвоената област ще остави оградената последователност извън хромозомата. Това е отново сайт-специфична рекомбинация. Повтореният участък е твърде къс, за да заработят механизмите на общата рекомбинация.
        Ако дадена ДНК-последователност се изреже и отново се интегрира, тя ще се окаже на съвсем друго място в генома. Процесът се нарича преместване или транспозиция. Понякога старото и новото място са сближени чрез нагъване на хромозомата в пространството. Тогава подвижната последователност може да се премести направо, без да пребивава в свободен вид извън хромозомата.
        Малките последователности, използващи сайт-специфична рекомбинация, често предпочитат, вместо просто да се местят, да се дуплицират и разпространяват. Схемата показва един от възможните механизми за дупликация, т.е. за преместване без напускане на старото място.

По този начин, ако видът се размножава полово, всяка последователност може да се разпространи в него.
Дупликацията може да се осъществява отново и отново, така че вместо две ще се получат много повече копия от изходната последователност. Такава многократна дупликация се нарича амплификация.

2. ДНК-последователности, осъществяващи сайт-специфична рекомбинация

2.1. Епизоми

Вече познаваме една група ДНК-молекули, които зависят от сайт-специфичната рекомбинация – прокариотните епизоми. Някои от тях като F-фактора имат любимо място за включване в хромозомата, т.е. определена последователност винаги им служи като прицелен участък.

2.2. Транспозони (подвижни генетични елементи)

        Други ДНК-последователности за разлика от епизомите не са склонни да пребивават в свободно състояние, но често променят местоположението и броя си в хромозомата. Наричат се подвижни генетични елементи или транспозони. Присъстват както в прокариотния, така и в еукариотния геном (първоначално са открити в царевица). Много от разпръснатите повтори в еукариотните хромозоми представляват подвижни елементи. По сегашните оценки еукариотният геном съдържа средно над 10% подвижни елементи.
        Транспозоните кодират ензимите, които катализират важните за тях процеси – интеграция, транспозиция, дупликация, изрязване. Само най-малките транспозони, които дори не винаги се удостояват с този термин, могат да не кодират нищо. Те разчитат на ензими, кодирани от други транспозони или дори от гени на клетката.
        Ензимите, отговорни за транспозицията на подвижните генетични елементи, се наричат транспозази. Малко транспозони изразяват предпочитания към определени места на интеграция. Повечето се наместват случайно.
        В двата си края транспозоните съдържат инвертирани повтори. Така транспозазите разпознават границите им. При това не е гарантирано, че ще се открият двете най-сближени граници. Ако два еднакви транспозона се намират сравнително близо един до друг, те могат да се местят като един по-голям елемент заедно с ДНК-участъка помежду им.
        За подвижните елементи никога не се знае докога ще бъдат на мястото си или, ако се разглежда друго място, докога няма да бъдат там. Не е изненадващо, че присъствието им силно дестабилизира генома. Ако двойка хомоложни хромозоми се различават по разположение или брой на транспозоните, хомоложната им рекомбинация може да протече по-трудно или с по-голяма вероятност за грешки. Някои гени върху транспозоните имат силни енхансери. При преместването на транспозона енхансерът може неподходящо да усили експресията на гените в близост до мястото на интеграция. Подвижните елементи могат да направят и обратното – да инактивират ген, като се интегрират в негов екзон или регулаторна последователност. Изобщо транспозоните влияят като останалите мутагени: могат да дават материал за еволюцията, но в близък план носят само неприятности. За щастие заложбите им за подвижност се проявяват рядко. Не се знае какво ги активира.

2.3. Лизогенни фаги

        Някой може вече да е забелязал, че със своето самоцелно съществуване и склонност да се ”размножават” в живата клетка транспозоните приличат на вирусните геноми. Сега ще видим, че обратното също е вярно – някои вируси напомнят транспозони и дори е възможно да са произлезли от тях.
        Един от най-важните белези, по които се различават вирусите, е отношението им към сайт-специфичната рекомбинация. Редица вируси и фаги се възпроизвеждат в цитоплазмата и не влизат в допир с клетъчната ДНК. Такъв е например вирусът на едрата шарка. Други, след като проникнат в клетката, интегрират своя геном в клетъчния чрез сайт-специфична рекомбинация подобно на епизомите и транспозоните. Когато вирусният геном е включен в клетъчна хромозома, той се нарича провирус, а ако става дума за прокариотна система – профаг.
        Най-известният пример при прокариотите е т. нар. ламбда-фаг. Когато неговата ДНК проникне в бактерията, понякога започва да се транскрибира и реплицира, докато се сглобят много нови фагови вириони и клетката се спука – литичен цикъл на развитие. Понякога обаче фаговата ДНК се интегрира в бактериалната хромозома, оставяйки гостоприемника да поживее още малко – лизогенен цикъл на развитие. Мястото на рекомбинация е строго определено. В процеса участват ензими не само на фага, а и на клетката.
        Бактерията, съдържаща профаг, изглежда и се държи нормално. Може да расте и да се дели многократно. Гените, отговорни за литичното развитие, са потиснати от репресор, който е продукт на друг фагов ген. Затова, ако в бактерията проникне нов ламбда-фаг, не може да я лизира. Скритата опасност обаче може да се ”събуди” при промяна на условията. Например при облъчване RecA се активира и причинява протеолитично срязване не само на репресора на SOS-блока, а и на репресора на гените за литично развитие. Понякога за ”събуждането” няма видима причина. Изведнъж профагът се изрязва от хромозомата и започва литичен цикъл, който завършва със смъртта на гостоприемника.
        Когато ламбда-фаг атакува бактерия, не може да се предскаже кой път на развитие ще се избере – има елемент на случайност. Бактерията, носеща профаг, се нарича лизогенна, тъй като винаги може да се лизира без ”помощта” на нов фаг. Присъствието на профага в бактериалната хромозома се нарича лизогения. Явлението е изгодно за фага, тъй като лизогенната бактерия, разполагайки с дълъг живот, би могла да го пренесе в нова колония. Можем да видим тук потвърждение на известното правило, че за паразита е по-добре да не убива бързо гостоприемника си.
        Между другото лизогенните фаги са способни да ”прихванат” участък ДНК от клетката и да го пренесат в следващия гостоприемник. Явлението се нарича трансдукция.

2.4. Онкогенни ДНК-вируси

        Сайт-специфична рекомбинация се наблюдава и при много еукариотни ДНК-вируси, които се реплицират в ядрото. Тяхната ДНК понякога се открива като провирус в генома на клетката-гостоприемник. Изглежда, мястото на интеграция е случайно. Рекомбинацията не е предвидена в развитието на тези вируси (за разлика от лизогенните фаги). При обикновени условия тя е много рядка. По-често се наблюдава, когато вирусът попадне в необичайни за него клетки (друга тъкан или друг вид гостоприемник), изобщо когато нормалното му развитие е затруднено. Вирусната ДНК, вместо да се транскрибира, реплицира и т.н., просто седи в ядрото, докато някакви ензими я забележат и се погрижат за нея. Най-вероятно това са клетъчните системи за репарация на двойноверижни скъсвания в ДНК. Веднъж интегриран, провирусът няма път назад.
        Краят на перспективите за вируса обаче може да бъде начало на самостоятелна кариера за клетката. По причини, които няма да разглеждаме сега, интеграцията на провирус може да трансформира клетката, т.е. да я накара да се дели неограничено. Ако изолираме клетки от организма и прибавим към тях подходящ вирус, с голяма вероятност ще получим безсмъртна клетъчна култура. В организма същите вируси могат да предизвикат рак, затова се наричат онкогенни.
        Онкогенност е установена за някои полиомавируси, папиломавируси, аденовируси и херпесвируси, както и за вируса на хепатит В. Този списък почти изчерпва семействата еукариотни ДНК-вируси, реплициращи се в ядрото. За да се предпазят вирусите от несправедливи обвинения, трябва да се отбележи, че: (1) онкогенни са не целите семейства, а само някои техни представители; (2) съвсем не всички онкогенни вируси са онкогенни именно за човека; и (3) нормално онкогенните вируси причиняват заразни болести и само в нищожна част от гостоприемниците се стига до рак.

2.5. Ретротранспозони

        Досега разглеждахме сайт-специфична рекомбинация, основана изцяло на ДНК. Има обаче група подвижни елементи, които при своята транспозиция и амплификация минават през РНК. Това са т. нар. ретротранспозони (ретропозони, ретрони), открити при най-различни еукариоти. Те кодират ензима обратна транскриптаза (РНК-зависима ДНК-полимераза), който синтезира ДНК върху матрица РНК. Оттам идва и името им (англ. reverse transcriptase - обратна транскриптаза).
        Транспозицията (или по-точно амплификацията) на ретротранспозона започва с презаписване и превеждане на гена за обратната транскриптаза. Полученият ензим синтезира върху РНК верига комплементарна ДНК (кДНК), а после замества РНК с втора верига кДНК. Двуверижната кДНК се интегрира на случайно място в генома. Това се извършва от транспозаза, също кодирана от ретротранспозона.
        Поне една група ретротранспозони са полезни за организма, който ги съдържа. Двукрилите насекоми, включително моделът Drosophila, в еволюцията си са останали без теломерази. Теломерите им се поддържат с помощта на ретротранспозони, които се интегрират специфично в хромозомните краища.
        Ензимите на ретротранспозоните не винаги разпознават своята РНК. В еукариотния геном има странни участъци, обясними само с обработка на нормална мРНК от ретротранспозонови ензими. Те се наричат процесирани псевдогени. Псевдогените изобщо са последователности, които явно някога са били гени, но след това са престанали да се експресират. Но докато повечето псевдогени приличат на активните гени, процесираните псевдогени приличат на мРНК: регулаторните последователности и интроните липсват, а има полиА-опашка. Явно това са интегрирани обратни транскрипти.

2.6. Ретровируси

        Докато обикновените транспозони приличат на лизогенните фаги, ретротранспозоните силно напомнят ретровирусите. Това е семейство еукариотни РНК-вируси, които кодират обратна транскриптаза и я носят във вириона си. Попаднали в клетката, ретровирусите синтезират върху геномната си РНК двуверижна кДНК и я интегрират на случайно място в клетъчна хромозома. Полученият провирус се презаписва и дава вирусни мРНК и нови геномни РНК. Така, докато лизогенните фаги встъпват в сайт-специфична рекомбинация по избор, а еукариотните ДНК-вируси – по недоразумение, ретровирусите я осъществяват по необходимост. Без интеграция развитието им не може да протече.
        Останалите РНК-вируси, например грипните, реплицират своята РНК, без да минават през ДНК. Това става с помощта на съвсем друг ензим – РНК-репликаза (РНК-зависима РНК-полимераза). Затова те нямат възможност да се интегрират в клетъчната ДНК и каквито и да са другите им недостатъци, поне не могат да предизвикат рак. Ретровирусите обаче са съвсем способни на това и много от тях го правят. Едно от трите подсемейства ретровируси дори е наречено Онкорнавируси (англ. Oncornaviruses, съкр. от oncogenic RNA viruses – онкогенни РНК-вируси). Не всички ретровируси обаче са онкогенни. Например не е установено вирусът на СПИН пряко да предизвиква рак.
        Някои вируси, най-вече ретровируси, могат да се интегрират в клетки от половия път. Провирусната ДНК ще се предава в поколенията. В по-изучените еукариотни геноми, включително човешкия, се откриват провируси в значително количество и разнообразие. Почти 1% от мишия геном се пада на ретровирусни провируси. Повечето от тях изглеждат безобидни и поне за някои е установено, че са загубили всяка възможна активност поради натрупани мутации. Други обаче са склонни да се местят и амплифицират като транспозоните. Както и при транспозоните, има опасност интеграцията да разкъса ген или регулаторен участък. При мишки е наблюдавано нарушено развитие и смърт на зародиши след интеграция на ретровирус в гена за колагена.
        Някои от унаследяваните провируси на ретровируси са запазили изцяло активността си. След транскрипция и транслация те могат да дадат пълноценни вириони. Така ненадейно в някоя тъкан на животното се появяват ретровируси, каквито иначе може да няма в близката околност. Един от животинските модели на инсулинзависимия диабет са мишките от чистата линия NOD (съкр. от англ. non-obese diabetic – незатлъстели диабетни). На определена възраст в панкреатичните им бета-клетки се активира провирус на ретровирус. Предполага се, че имунният отговор срещу ретровирусните антигени се усилва ненужно, докато унищожи повечето бета-клетки и се развие диабет. Други линии мишки носят провируси, чиято активация причинява вирусна левкемия.

3. Значение на сайт-специфичната рекомбинация

        След всичко казано по-горе човек може да сметне собствения си геном за гнездо на задрямали чудовища и да се замисли за лекарства, които да предотвратят сайт-специфичната рекомбинация. Нещата обаче не са толкова черни. При цялото изобилие от подвижни генетични елементи ние обикновено се разболяваме и умираме по други причини. Следователно положението като цяло е под контрол. От транспозони и ретровируси страдат най-често опитни животни от чисти линии. Те не са много приспособени, тъй като при родственото кръстосване в някои локуси случайно се настаняват дефектни алели. Вероятно геномът се дестабилизира и от самия факт, че всички гени са в хомозиготно състояние. Хетерозиготите от природните популации, включително човешката, изглеждат по-устойчиви. Освен това твърдения като ”транспозоните не са от полза за клетката” са рисковани при оскъдните ни познания за еукариотния геном.
        Едно от най-ефективните средства за защита от патогени се основава на сайт-специфична рекомбинация. Организмът на гръбначните животни може да реагира не само срещу патогените изобщо (вроден имунитет), а и срещу конкретен патоген съобразно неговия молекулен (антигенен) състав – придобит имунитет. Основа на придобития имунитет са антиген-специфичните рецептори на В- и Т-лимфоцитите. В-клетъчният рецептор е имуноглобулин – антитяло. Състои се от 2 вериги, всяка в по 2 копия. Имуноглобулиновите вериги в по-голямата си част са еднакви при всички лимфоцити, но точно участъкът, който свързва антигена, е различен при отделните В-клетки, макар и еднакъв по цялата повърхност на всяка от тях. Когато в организма проникне антиген, кръвта и лимфата го отнасят до В-лимфоцитите. Измежду многото разнообразни имуноглобулинови рецептори все някои му подхождат по пространствена структура. Те го свързват и задържат, при което клетката-собственик усеща, че я ”дърпат за косата”. Тя се активира и се дели по най-бързия възможен начин. Потомците й синтезират същото антитяло вече в разтворим вид и го секретират. (При разтворимото антитяло мембранният домен на рецептора липсва поради разлика в зреенето на мРНК – вж. раздел Зреене.)
    Изследователите са били удивени от способността на имунната система да прави антитела срещу всеки антиген, който може да се измисли. Това може да изисква милиони различни антитела, докато броят на гените при бозайници се оценява най-много на 100_000 и някои от тях трябва да се оставят за друга употреба. По-късно се е установило, че противоречие няма. В клетките от половия път за имуноглобулиновите вериги са предвидени само няколкостотин гена. Те обаче кодират не самите вериги, а отделни техни части. При диференцирането на В-лимфоцитите трябва изходните малки гени да се съчетаят, за да може от частите да се получат големи гени за цели вериги. За това съчетаване има много възможни начини и всеки бъдещ В-лимфоцит ”реже и лепи” случайно. Така от няколкостотин изходни гена се получават милиони крайни варианти. (Има и механизми за допълнително разнообразяване, които засега няма да обсъждаме.)
        На схемата е дадено пренареждането на гените за тежката (т.е. по-голямата) имуноглобулинова верига. При другата (леката) имуноглобулинова верига събитията протичат почти по същия начин.

Рекомбинация на гените за тежката имуноглобулинова верига при мишка и резултат от презаписването на така "сглобения" ген. Опростено и с изменения по Golub (1987).

Вижда се, че зародишните гени се пренареждат, като участъците ДНК между тях се премахват. Това изрязване е акт на сайт-специфична рекомбинация и се осъществява от ензими, наречени рекомбинази. При работата си те се ръководят от специални белези между малките зародишни гени. Тези белези са къси палиндромни ДНК-последователности, способни да образуват лесна за разпознаване вторична структура, наподобяваща фиба. Като се срязва в тези места, се осигурява точност на рекомбинацията.

        Двете вериги на антиген-специфичния рецептор на Т-лимфоцитите не са имуноглобулинови, но гените им се пренареждат аналогично.
        Ако организмът поради рецесивна мутация няма рекомбинази, то няма да има и зрели антиген-разпознаващи лимфоцити – нито В-, нито Т-. Болестта се нарича тежка комбинирана имунна недостатъчност. Болните деца могат да бъдат спасени само чрез присаждане на костен мозък, в противен случай бързо стават жертва на инфекции. Следователно сайт-специфичната рекомбинация ни е жизнено необходима.
        Пренареждането на гените за В- и Т-клетъчните рецептори е уникален пример за целенасочена промяна на ДНК. По правило клетъчното диференциране е свързано с промени в активността на ДНК, но не и в нейната последователност. При няколко типа клетки (например еритроцитите) накрая се изхвърля цялото ядро, но тази промяна, макар и по-радикална, изглежда по-проста.
        За да бъде картината пълна, следва да се спомене отговорът на врага. Както имунната система разчита на разнообразие, така и редица патогени променят антигенния си състав, за да й се изплъзнат. Най-известни са безкрайните вариации на грипния вирус. Той обаче е РНК- а не ДНК-вирус, и се променя за сметка на мутации и пресъчетаване на цели РНК-молекули, а не на рекомбинации. По-типичен пример са трипанозомите – причинители на сънната болест. Обитавайки кръвната плазма, трипанозомата е добра мишена за антителата. Тя обаче се е приспособила да променя антигенния си облик. В генома й има около 1000 гена (около 10%) за белтъци, с които може да се покрие повърхността й. Във всеки момент обаче се използва само един от гените. Той е дуплициран, второто му копие е интегрирано на специално място (до едната теломера) и именно то се презаписва – пример за ефект на положението. Когато се натрупат антитела срещу основния повърхностен белтък, генът му се изрязва от привилегированото място чрез сайт-специфична рекомбинация. Там се интегрира копие на друг от 1000-та гена. Резултатът е нов повърхностен белтък и неуязвимост към старите антитела. Имунната система трябва да започне отначало.
        Ясно е, че значението на рекомбинацията е твърде разнообразно, за да се обсъжда накратко. Общата рекомбинация се използва за репарация на реплицирана ДНК и за получаване на нови генни съчетания. Това дава материал за еволюцията, а понякога и незабавна изгода. Чрез хомоложна рекомбинация също така може, макар и не целенасочено, да се променя броят на тандемните повтори. Сайт-специфичната рекомбинация се подчинява на по-малко строги правила и внася в ДНК по-големи преобразувания. Затова тя е по-опасна и по-рядко се извършва ”по желание” на клетката. Геномите на съвременните организми обаче показват, че много промени, получени чрез сайт-специфична рекомбинация, в крайна сметка са били утвърдени от естествения отбор.

Основни източници

Alberts B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson. Molecular Biology of the Cell. 3rd Edition. Garland Publishing Inc., New York, London, 1994. [Online] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=cell (основен източник)

Lewin B. Genes. John Wiley & Sons Inc., New York, 1983.

За мишките с повредения колагенов ген: Курильски Ф., Г. Гашлен. Организация генома. В: Генетика и наследственость. Мир, Москва, 1987. За теломерите на дрозофилата: Nakamura T.M., T.R. Cech (1998). Reversing time: origin of telomerase. Cell 92: 587-590. За имуноглобулиновите гени:

Golub E.S. Immunology, a synthesis. Sinauer Associates, Inc., 1987.

Предишен раздел
Основна страница
Следващ раздел